Plasmide CRISPR d'Activation (h) R-Ras: sc-402126-ACT

RRAS code la petite GTPase R-Ras, un nœud de signalisation de la famille Ras qui alterne entre des états liés au GDP et au GTP afin de réguler l’adhésion dépendante des intégrines, la dynamique du cytosquelette et le trafic membranaire. Dans les cellules humaines, R-Ras contribue au contrôle de la migration cellulaire et des signaux de survie via des voies qui croisent les cascades PI3K/AKT et MAPK, influençant le comportement des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses. Une activité RRAS altérée a été associée à un remodelage vasculaire dérégulé et à des programmes de motilité cellulaire aberrants observés dans le cancer et des troubles du développement. Ces propriétés font de RRAS une cible utile pour analyser la signalisation médiée par l’adhésion, les phénotypes d’invasion et l’architecture contextuelle des réseaux Ras.

R-Ras Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RRAS sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

R-Ras Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RRAS dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RRAS, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de R-Ras. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RRAS natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de R-Ras au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie R-Ras dans les cellules tumorales présentant une expression de RRAS silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.