Plasmide CRISPR d'Activation (h) PU.1/Spi1: sc-400547-ACT

SPI1 code PU.1 (Spi1), un facteur de transcription de la famille ETS qui agit comme régulateur déterminant de la lignée lors de la différenciation hématopoïétique, en particulier dans les compartiments myéloïde et des lymphocytes B. PU.1 se fixe à des motifs ETS conservés afin d’orchestrer des programmes transcriptionnels contrôlant l’engagement des progéniteurs, la présentation de l’antigène, les composantes de la signalisation des immunoglobulines et les gènes effecteurs de l’immunité innée, en intégrant des signaux issus des voies des cytokines et des facteurs de croissance. Une modification du dosage de SPI1 ou du câblage de son réseau perturbe l’homéostasie hématopoïétique et est impliquée dans la leucémogenèse ainsi que dans la dysrégulation immunitaire, via des effets en aval sur la différenciation, la prolifération et l’expression de gènes inflammatoires. En tant que nœud central des circuits de régulation génique hématopoïétiques, PU.1 est largement utilisé pour modéliser les décisions de destin cellulaire pilotées par des facteurs de transcription et pour cartographier la connectivité entre enhancers et promoteurs dans les cellules immunitaires.

PU.1/Spi1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SPI1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PU.1/Spi1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SPI1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SPI1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PU.1/Spi1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SPI1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PU.1/Spi1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PU.1/Spi1 dans les cellules tumorales présentant une expression de SPI1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.