PRX IV CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402821-ACT

Peroxiredoxin 4 (PRDX4; PRX IV) ist eine thiolabhängige Peroxidase, die vorwiegend im endoplasmatischen Retikulum (ER) und im sekretorischen Weg lokalisiert ist. Dort katalysiert sie die Reduktion von Wasserstoffperoxid und organischen Hydroperoxiden und trägt so zur Aufrechterhaltung der Redox-Homöostase bei. Durch die Kopplung der Peroxid-Entgiftung an die oxidative Proteinfaltung ist PRX IV in ER-Stressreaktionen und die Signalwege der unfolded protein response (UPR) eingebunden und beeinflusst damit Proteostase, Sekretion und das Zellüberleben unter oxidativen Bedingungen. Eine veränderte PRDX4-Aktivität wurde mit einer fehlregulierten Redox-Signalgebung bei Entzündungen und metabolischem Stress in Verbindung gebracht und wird häufig in Kontexten untersucht, in denen oxidativer Stress die Tumorbiologie, die Funktion von Immunzellen und die Physiologie sekretorischer Gewebe prägt. Als Redox-Regulator überschneidet sich PRX IV zudem mit peroxidvermittelten Signalknoten, die Kinasewege und transkriptionelle Programme modulieren, die mit zellulärer Anpassung verknüpft sind.

PRX IV Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRDX4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PRX IV Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRDX4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRDX4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PRX IV-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRDX4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PRX IV-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PRX IV-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRDX4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.