Plasmide CRISPR d'Activation (h2) PRPK: sc-405589-ACT-2

Chez l’humain, TP53RK code PRPK (p53-related protein kinase), une composante catalytique du complexe KEOPS, qui assure la modification essentielle des ARNt en N6‑thréonylcarbamoyladénosine (t6A), influençant ainsi la fidélité de la traduction et la protéostasie globale. PRPK a été impliquée dans la régulation de la croissance cellulaire et des programmes d’adaptation au stress, avec des liens rapportés à des contextes de signalisation associés à p53 et, plus largement, au contrôle de processus liés à la prolifération. La perturbation génétique de TP53RK/PRPK est associée à des phénotypes du développement et du neurodéveloppement, notamment le syndrome de Galloway–Mowat, soulignant l’importance du métabolisme de l’ARN médié par KEOPS pour l’homéostasie de l’organisme. L’édition du gène TP53RK permet des études mécanistiques de la traduction dépendante des modifications des ARNt, de l’assemblage du complexe KEOPS et des effets en aval sur le cycle cellulaire, le maintien du génome et les voies de réponse au stress dans des modèles cellulaires humains.

PRPK Le plasmide d'activation CRISPR (h2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TP53RK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PRPK Le plasmide d'activation CRISPR (h2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TP53RK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TP53RK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PRPK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TP53RK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PRPK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PRPK dans les cellules tumorales présentant une expression de TP53RK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.