Plasmide CRISPR d'Activation (h) PRP4 kinase: sc-411224-ACT

PRPF4B code la kinase PRP4, une sérine/thréonine kinase qui s’associe aux complexes du spliceosome et soutient l’épissage des pré-ARNm ainsi que la dynamique du spliceosome. Par la phosphorylation de facteurs liés à l’épissage, la kinase PRP4 contribue à la régulation des profils d’épissage alternatif qui façonnent la production du transcriptome au cours de la progression du cycle cellulaire et des réponses au stress. Une perturbation de l’activité de PRPF4B peut altérer la fidélité du traitement des ARN et les programmes d’expression génique en aval, reliant cette kinase à des voies pertinentes pour la maintenance du génome et les réseaux de signalisation. Des programmes d’épissage dérégulés impliquant PRPF4B ont été étudiés dans le contexte de phénotypes de prolifération et de différenciation, ce qui en fait un nœud utile pour des études mécanistiques du traitement de l’ARN dans les cellules humaines.

PRP4 kinase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRPF4B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PRP4 kinase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRPF4B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRPF4B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PRP4 kinase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRPF4B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PRP4 kinase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PRP4 kinase dans les cellules tumorales présentant une expression de PRPF4B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.