Plasmide CRISPR d'Activation (h) PrP: sc-401061-ACT

PRNP code la protéine prion cellulaire (PrP), une glycoprotéine membranaire ancrée par un glycosylphosphatidylinositol (GPI), particulièrement abondante à la surface des neurones et au sein des radeaux lipidiques. La PrP participe à la protéostasie et à des processus de signalisation associés à la membrane, notamment le trafic endocytaire, l’homéostasie rédox et la modulation de la fonction synaptique via des interactions avec des composants de la matrice extracellulaire et des partenaires d’adhérence cellulaire. Le mauvais repliement de la PrP en conformères résistants aux protéases est à l’origine des encéphalopathies spongiformes transmissibles et est lié à une neurodégénérescence caractérisée par une agrégation protéique, une altération des réponses cellulaires au stress et une dysfonction neuronale progressive. La régulation de PRNP est donc pertinente pour l’étude des voies impliquées dans le contrôle qualité du repliement des protéines, la signalisation neuro-inflammatoire et les mécanismes de survie neuronale.

PrP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRNP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PrP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRNP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRNP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PrP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRNP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PrP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PrP dans les cellules tumorales présentant une expression de PRNP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.