Plasmide CRISPR d'Activation (h) Prothrombin: sc-400962-ACT

F2 code la prothrombine, un zymogène dépendant de la vitamine K qui est converti par protéolyse en thrombine, une sérine-protéase centrale de la cascade de coagulation. La thrombine clive le fibrinogène en fibrine, amplifie la coagulation via l’activation des facteurs V, VIII, XI et XIII, et couple l’hémostase à des réponses cellulaires par la signalisation des récepteurs activés par les protéases (PAR) dans les plaquettes et les cellules vasculaires. La régulation de l’activation de la prothrombine recoupe des voies anticoagulantes, notamment l’antithrombine et le système de la protéine C, modulant la cinétique de génération de thrombine et la stabilité du caillot. Une expression ou une activité dérégulée de F2 est associée à un déséquilibre de la coagulation et à des phénotypes thrombotiques, ce qui en fait un nœud mécanistique pertinent pour étudier l’hémostase et la biologie vasculaire liée à l’inflammation.

Prothrombin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de F2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Prothrombin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus F2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription F2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Prothrombin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus F2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Prothrombin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Prothrombin dans les cellules tumorales présentant une expression de F2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.