Prickle4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-412059-ACT

PRICKLE4 kodiert Prickle4, ein Mitglied der Prickle-Familie von Regulatoren der planaren Zellpolarität (PCP), die während der Entwicklung und Gewebeorganisation gerichtete Zellverhaltensweisen koordinieren. Prickle-Proteine sind an der nicht-kanonischen Wnt/PCP-Signalgebung beteiligt und beeinflussen die Zytoskelettdynamik, die Etablierung der Zellpolarität sowie die polarisierte Migration, mit nachgeschalteten Effekten auf die Morphogenese und die epitheliale Architektur. Eine Fehlregulation von PCP-Komponenten kann Zellbewegung und polaritätsabhängige Prozesse stören, die häufig mit Entwicklungsanomalien und mit den veränderten Migrationsprogrammen in der Krebsbiologie in Zusammenhang stehen. Die PRICKLE4-Expression und die Aktivität des Signalwegs sind daher für mechanistische Studien von Interesse, die Wnt/PCP-Signalgebung mit der Kontrolle von Zellform, Adhäsion und Gewebemusterbildung verknüpfen.

Prickle4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRICKLE4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Prickle4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRICKLE4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRICKLE4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Prickle4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRICKLE4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Prickle4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Prickle4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRICKLE4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.