Plasmide CRISPR d'Activation (h) PRHOXNB: sc-416145-ACT

Le gène humain URAD code la protéine PRHOXNB, un régulateur transcriptionnel putatif impliqué dans le contrôle de programmes d’expression génique qui façonnent l’identité cellulaire et les transitions d’état. En influençant l’activité des promoteurs et des enhancers, PRHOXNB devrait interagir avec des processus transcriptionnels et de régulation de la chromatine centraux, qui coordonnent la prolifération, la différenciation et les réponses adaptatives au stress. Une régulation aberrante des réseaux de facteurs de transcription est une caractéristique récurrente de la biologie des maladies complexes, ce qui fait d’URAD/PRHOXNB une cible pertinente pour des études mécanistiques du remodelage des voies et de la plasticité phénotypique. La modulation de l’expression d’URAD offre un moyen d’interroger les réseaux géniques en aval et leur contribution à des comportements cellulaires dépendants du contexte.

PRHOXNB Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de URAD sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PRHOXNB Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus URAD dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription URAD, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PRHOXNB. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus URAD natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PRHOXNB au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PRHOXNB dans les cellules tumorales présentant une expression de URAD silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.