Plásmido CRISPR de Activación (h) Prestin: sc-401428-ACT

SLC26A5 codifica prestina, una proteína motora unida a la membrana, similar a un transportador de aniones, que está altamente enriquecida en las células ciliadas externas cocleares y convierte los cambios en el potencial de membrana en una electromotilidad rápida. Esta transducción electromecánica sustenta la amplificación coclear y un ajuste fino de la frecuencia, integrando la homeostasis iónica con un ciclo conformacional dependiente del voltaje en la membrana plasmática. La actividad de la prestina está vinculada a procesos epiteliales de transporte de iones y a la mecánica especializada del citoesqueleto y de la membrana requerida para la función auditiva. La expresión o función alteradas de SLC26A5 se asocian con fenotipos de hipoacusia neurosensorial y se utiliza como un punto de entrada molecular para estudiar la biomecánica de las células ciliadas y la desregulación de la vía auditiva.

Prestin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SLC26A5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Prestin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SLC26A5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SLC26A5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Prestin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SLC26A5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Prestin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Prestin en células tumorales con expresión de SLC26A5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.