Plasmide CRISPR d'Activation (h) PRAK: sc-403215-ACT

Le gène humain MAPKAPK5 code PRAK (p38-regulated/activated kinase), une kinase sérine/thréonine activée en aval des voies de signalisation MAPK sensibles au stress, en particulier de l’axe p38 MAPK. PRAK participe à des programmes de phosphorylation qui façonnent les réponses cellulaires aux signaux inflammatoires, au stress oxydatif et aux dommages à l’ADN, avec des rôles rapportés dans la régulation des réseaux transcriptionnels, de la dynamique du cytosquelette et des points de contrôle du cycle cellulaire. Par ces fonctions, MAPKAPK5/PRAK est fréquemment étudié dans des contextes où la signalisation de stress reconfigure les programmes de croissance et de survie, notamment en biologie du cancer et dans des phénotypes associés à l’inflammation chronique. Sa connectivité au sein des voies en fait un nœud utile pour disséquer le dialogue croisé des signalisations pilotées par les MAPK et les réponses adaptatives au stress dans les cellules humaines.

PRAK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MAPKAPK5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PRAK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MAPKAPK5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MAPKAPK5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PRAK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MAPKAPK5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PRAK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PRAK dans les cellules tumorales présentant une expression de MAPKAPK5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.