Plasmide CRISPR d'Activation (h) PR3: sc-402550-ACT

PRTN3 code la protéinase 3 (PR3), une protéase à sérine des neutrophiles stockée dans les granules azurophiles et mobilisée vers les phagosomes ainsi qu’à la surface cellulaire lors de l’activation de l’immunité innée. PR3 contribue à la défense antimicrobienne et à la signalisation inflammatoire en assurant le clivage protéolytique de composants de la matrice extracellulaire, de cytokines et de réseaux de chimiokines, en interaction avec les voies de dégranulation, de formation de NET (pièges extracellulaires des neutrophiles) et de trafic leucocytaire. Une activité de PR3 dérégulée et une reconnaissance immunitaire aberrante sont associées à des lésions tissulaires inflammatoires et constituent des marqueurs mécanistiques importants dans les études des pathologies induites par les neutrophiles, notamment les processus vasculitiques auto-immuns. La dynamique d’expression de PRTN3 est donc fréquemment étudiée dans des modèles de différenciation myéloïde, des essais de signalisation inflammatoire et des analyses de cartographie des voies protéase–substrat.

PR3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRTN3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PR3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRTN3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRTN3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PR3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRTN3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PR3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PR3 dans les cellules tumorales présentant une expression de PRTN3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.