PPP1R3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405135-ACT

PPP1R3A codifica a PPP1R3, uma subunidade reguladora da proteína fosfatase 1 direcionada ao glicogénio, que ajuda a localizar a PP1 catalítica nas partículas de glicogénio e a coordenar a desfosforilação de enzimas metabólicas-chave. Ao modular a atividade da glicogénio sintase e da fosforilase, a PPP1R3A contribui para a dinâmica de armazenamento de glicose e integra a sinalização responsiva à insulina com o metabolismo dos hidratos de carbono no músculo esquelético e noutros tecidos sensíveis à insulina. Alterações na expressão ou na regulação de PPP1R3A têm sido associadas a um manuseamento desregulado do glicogénio e a fenótipos metabólicos, tornando-a relevante para estudos de sinalização da insulina, homeostase energética e adaptação metabólica específica de tecidos. Como regulador tipo “scaffold” da PP1, a PPP1R3A também serve como um nó acessível para dissecar mecanismos de direcionamento de fosfatases dentro de redes mais amplas de fosforilação.

PPP1R3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PPP1R3A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PPP1R3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PPP1R3A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PPP1R3A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PPP1R3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PPP1R3A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PPP1R3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PPP1R3 em células tumorais com expressão de PPP1R3A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.