Plasmide CRISPR d'Activation (h) PPP1R15B: sc-408988-ACT

PPP1R15B (également connu sous le nom de CReP) code une sous-unité régulatrice qui cible la phosphatase 1 des protéines (PP1) afin de déphosphoryler eIF2α, jouant un rôle clé de contrepoids à la répression de la traduction induite par le stress. En favorisant la déphosphorylation d’eIF2α, PPP1R15B aide à rétablir la synthèse protéique globale après des perturbations et module la signalisation de la réponse intégrée au stress (ISR), qui s’articule avec le stress du réticulum endoplasmique (RE), la protéostasie et les programmes de survie cellulaire. Ce contrôle dirigé par PP1 influence les voies d’adaptation transcriptionnelles et métaboliques en aval, régies par des réseaux dépendants d’ATF4/CHOP. Une dérégulation de la dynamique de phosphorylation d’eIF2α et du réglage fin de l’ISR a été impliquée dans divers contextes, notamment la neurodégénérescence, le stress métabolique et l’adaptation des cellules cancéreuses, faisant de PPP1R15B un nœud pertinent pour des études mécanistiques sur la résilience au stress.

PPP1R15B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PPP1R15B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PPP1R15B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PPP1R15B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PPP1R15B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PPP1R15B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PPP1R15B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PPP1R15B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PPP1R15B dans les cellules tumorales présentant une expression de PPP1R15B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.