Plasmide CRISPR d'Activation (h) PPP1R12C: sc-412332-ACT

PPP1R12C code MYPT3, une sous-unité régulatrice de la phosphatase de la myosine qui cible la protéine phosphatase 1 (PP1) vers la myosine II et des substrats apparentés afin de moduler la contractilité actomyosine. En façonnant la dynamique de phosphorylation des chaînes légères de la myosine, PPP1R12C contribue à l’organisation du cytosquelette, à l’adhésion cellulaire, à la motilité et aux voies de mécanotransduction qui influencent l’architecture tissulaire et la fonction de barrière. Une régulation altérée de la déphosphorylation dépendante de PP1 a été associée à une migration cellulaire dérégulée et à une signalisation contractile anormale, des processus fréquemment impliqués en biologie cardiovasculaire et en oncologie. En tant que nœud reliant le ciblage des phosphatases à la contractilité pilotée par RhoA/ROCK, PPP1R12C est pertinent pour l’étude des réseaux de signalisation par phosphorylation et des phénotypes dépendants du cytosquelette.

PPP1R12C Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PPP1R12C sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PPP1R12C Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PPP1R12C dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PPP1R12C, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PPP1R12C. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PPP1R12C natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PPP1R12C au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PPP1R12C dans les cellules tumorales présentant une expression de PPP1R12C silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.