Plasmide CRISPR d'Activation (h) PP2B-Aα: sc-401810-ACT

PPP3CA code pour la sous-unité catalytique Aα de la calcineurine (PP2B‑Aα), une phosphatase sérine/thréonine dépendante du Ca2+/calmoduline qui couple les signaux calciques intracellulaires à des programmes transcriptionnels et synaptiques dépendants de la phosphorylation. La calcineurine déphosphoryle des substrats clés, notamment les facteurs de transcription NFAT, régulant ainsi l’expression génique dépendante du calcium, la signalisation immunitaire et le remodelage neuronal dépendant de l’activité. Dans les tissus excitables, PPP3CA contribue à la plasticité synaptique et à la régulation des canaux ioniques, tandis que, dans des contextes plus larges, elle intègre les flux de Ca2+ avec des nœuds de signalisation contrôlés par les MAPK et les phosphatases. Une activité altérée de la calcineurine et une dérégulation de PPP3CA ont été associées à des phénotypes neurodéveloppementaux et neurodégénératifs, ainsi qu’à une signalisation inflammatoire perturbée, ce qui en fait une cible utile pour des études mécanistiques centrées sur des voies de signalisation.

PP2B-Aα Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PPP3CA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PP2B-Aα Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PPP3CA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PPP3CA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PP2B-Aα. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PPP3CA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PP2B-Aα au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PP2B-Aα dans les cellules tumorales présentant une expression de PPP3CA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.