Plasmide CRISPR d'Activation (h) PP2A-Aα: sc-400876-ACT

PPP2R1A code la sous-unité d’échafaudage Aα de la protéine phosphatase 2A (PP2A), une phosphatase majeure des résidus sérine/thréonine qui assemble des sous-unités catalytiques et régulatrices afin de définir la spécificité des substrats et la localisation subcellulaire. PP2A‑Aα coordonne la déphosphorylation au sein de réseaux de signalisation centraux, notamment MAPK/ERK, PI3K–AKT–mTOR, Wnt/β‑caténine, ainsi que le contrôle des points de contrôle du cycle cellulaire, influençant ainsi la prolifération, la différenciation et les réponses au stress. Une altération de la fonction de PPP2R1A ou de la composition de l’holoenzyme PP2A est associée à une dérégulation de l’homéostasie de la phosphorylation et à une instabilité génomique, et des variants de PPP2R1A sont retrouvés de façon récurrente dans de nombreux types de tumeurs. Ce gène est fréquemment étudié dans les contextes de la régulation de la mitose, de la signalisation des dommages à l’ADN et de la modulation, par les phosphatases, des voies oncogéniques.

PP2A-Aα Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PPP2R1A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PP2A-Aα Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PPP2R1A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PPP2R1A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PP2A-Aα. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PPP2R1A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PP2A-Aα au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PP2A-Aα dans les cellules tumorales présentant une expression de PPP2R1A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.