Plasmide CRISPR d'Activation (h) PP1α: sc-400318-ACT

PPP1CA code la sous-unité catalytique de la phosphatase protéique 1 alpha (PP1α), une phosphatase majeure des sérines/thréonines qui contrebalance la signalisation des kinases afin de maintenir l’homéostasie de la phosphorylation des protéines. PP1α participe à la progression du cycle cellulaire, à la ségrégation des chromosomes, au métabolisme du glycogène et au remodelage du cytosquelette via des complexes holoenzymatiques formés avec diverses sous-unités régulatrices, qui déterminent la spécificité des substrats et la localisation subcellulaire. En modulant l’état de phosphorylation de protéines clés de signalisation et de structure, PPP1CA influence des voies contrôlant la prolifération, les réponses aux dommages de l’ADN et l’adaptation au stress cellulaire. Une activité de PP1α ou un adressage de celle-ci dérégulés ont été associés à des états de signalisation phospho anormaux observés dans de multiples contextes pathologiques, ce qui soutient son utilisation comme nœud mécanistique dans des études de voies et à l’échelle des systèmes.

PP1α Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PPP1CA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PP1α Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PPP1CA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PPP1CA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PP1α. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PPP1CA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PP1α au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PP1α dans les cellules tumorales présentant une expression de PPP1CA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.