Plásmido CRISPR de Activación (h) Pol III RPC32: sc-417072-ACT

POLR3G codifica la subunidad RPC32 de la Pol III, un componente central de la ARN polimerasa III necesario para la transcripción de pequeños ARN no codificantes, incluidos los ARNt y el ARNr 5S, que respaldan la biogénesis de ribosomas y la proteostasis. A través de su papel en el ensamblaje de la Pol III y en el inicio dependiente del promotor, la RPC32 de la Pol III contribuye a programas de crecimiento celular y a la adaptación metabólica vinculada al sensorado de nutrientes y a las respuestas al estrés. La regulación alterada de la producción de la Pol III y de sus subunidades accesorias se ha asociado con proliferación desregulada y con vías de señalización de la inmunidad innata, lo que convierte a POLR3G en una diana útil para investigar el control transcripcional de redes de ARN pequeños. El estudio de la función de POLR3G puede ayudar a aclarar cómo la actividad de la Pol III se integra con la regulación de la cromatina y la homeostasis del ARN en estados celulares relevantes para enfermedades.

Pol III RPC32 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de POLR3G sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Pol III RPC32 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus POLR3G en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional POLR3G, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Pol III RPC32. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo POLR3G y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Pol III RPC32 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Pol III RPC32 en células tumorales con expresión de POLR3G silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.