Pol II Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400053-ACT

POLR2A codifica a maior subunidade da RNA polimerase II (Pol II) humana, a enzima central que sintetiza mRNA e muitos RNAs não codificantes e integra a pausa proximal ao promotor, o alongamento e o processamento de RNA co-transcricional. A função da Pol II é coordenada ao longo do ciclo de transcrição por meio da fosforilação do domínio C-terminal, acoplando a transcrição ao splicing, ao capeamento 5′ e à formação da extremidade 3′, além de conectar programas de expressão gênica à regulação da cromatina e às respostas a danos no DNA. Como um nó central no controle transcricional, POLR2A é frequentemente utilizada como referência para a produção transcricional global e para a adaptação celular ao estresse. Alterações na atividade da Pol II e a desregulação da transcrição estão amplamente associadas a estados transcricionais oncogênicos e a fenótipos do neurodesenvolvimento, tornando POLR2A relevante para estudos mecanísticos de regulação gênica.

Pol II O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de POLR2A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Pol II O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus POLR2A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição POLR2A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Pol II. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus POLR2A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Pol II no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Pol II em células tumorais com expressão de POLR2A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.