Plasmide CRISPR d'Activation (h) Pol II: sc-400053-ACT

POLR2A code la plus grande sous-unité de l’ARN polymérase II humaine (Pol II), l’enzyme centrale qui synthétise l’ARNm ainsi que de nombreux ARN non codants et qui coordonne la pause proximale au promoteur, l’élongation et la maturation co‑transcriptionnelle de l’ARN. Le fonctionnement de Pol II est orchestré au cours du cycle de transcription par la phosphorylation du domaine C‑terminal, ce qui couple la transcription à l’épissage, à l’ajout de la coiffe en 5′ et à la formation de l’extrémité 3′, tout en reliant les programmes d’expression génique à la régulation de la chromatine et aux réponses aux dommages de l’ADN. En tant que nœud central du contrôle transcriptionnel, POLR2A est fréquemment utilisé comme référence de la production transcriptionnelle globale et de l’adaptation cellulaire au stress. Une activité altérée de Pol II et une dérégulation de la transcription sont largement associées à des états transcriptionnels oncogéniques et à des phénotypes neurodéveloppementaux, ce qui fait de POLR2A une cible pertinente pour les études mécanistiques de la régulation génique.

Pol II Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de POLR2A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Pol II Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus POLR2A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription POLR2A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Pol II. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus POLR2A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Pol II au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Pol II dans les cellules tumorales présentant une expression de POLR2A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.