Plásmido CRISPR de Activación (h) PNK: sc-404266-ACT

El gen humano **PNKP** codifica la polinucleótido quinasa 3′-fosfatasa (PNK), una enzima bifuncional de procesamiento de extremos de ADN que restaura los extremos 5′-fosfato y 3′-hidroxilo necesarios para la ligación durante la reparación de roturas de cadena sencilla del ADN. PNK actúa aguas abajo de PARP1 y XRCC1 y se conecta con la reparación por escisión de bases y la unión de extremos no homóloga al preparar extremos de ADN dañados generados por especies reactivas de oxígeno, radiación ionizante y reacciones abortivas de topoisomerasas. A través de estas vías, PNKP ayuda a preservar la estabilidad del genoma y favorece la replicación y la transcripción normales en células proliferativas y posmitóticas. La alteración del procesamiento de extremos mediado por PNKP se asocia con una mayor sensibilidad al estrés genotóxico y se ha relacionado con fenotipos del neurodesarrollo y neurodegenerativos derivados de una capacidad defectuosa de reparación del ADN.

PNK El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PNKP sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PNK El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PNKP en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PNKP, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PNK. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PNKP y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PNK en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PNK en células tumorales con expresión de PNKP silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.