Plasmide CRISPR d'Activation (h) PNK: sc-404266-ACT

Le gène humain **PNKP** code la polynucléotide kinase 3′-phosphatase (PNK), une enzyme bifonctionnelle de maturation des extrémités de l’ADN qui rétablit les extrémités 5′-phosphate et 3′-hydroxyle nécessaires à la ligature lors de la réparation des cassures simple brin de l’ADN. PNK agit en aval de PARP1 et de XRCC1 et s’articule avec la réparation par excision de base et la jonction d’extrémités non homologues en préparant les extrémités d’ADN endommagées générées par les espèces réactives de l’oxygène, les rayonnements ionisants et des réactions avortées de topoisomérases. Par ces voies, PNKP contribue à préserver la stabilité du génome et soutient une réplication et une transcription normales dans les cellules proliférantes comme dans les cellules post-mitotiques. La perturbation de la maturation des extrémités médiée par PNKP est associée à une sensibilité accrue au stress génotoxique et a été reliée à des phénotypes neurodéveloppementaux et neurodégénératifs résultant d’une capacité de réparation de l’ADN défectueuse.

PNK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PNKP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PNK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PNKP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PNKP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PNK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PNKP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PNK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PNK dans les cellules tumorales présentant une expression de PNKP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.