Plásmido CRISPR de Activación (h) plasma kallikrein: sc-402237-ACT

KLKB1 codifica la calicreína plasmática, una proteasa de serina que actúa en el sistema de activación por contacto para regular la coagulación intrínseca, la fibrinólisis y la señalización inflamatoria. Tras su activación, la calicreína plasmática escinde el cininógeno de alto peso molecular para liberar bradicinina, vinculando la actividad de KLKB1 con la permeabilidad vascular, la biología del edema y vías moduladoras de citocinas. También participa en la activación recíproca con el factor XII de la coagulación y puede influir en la señalización de los receptores activados por proteasas y en cascadas relacionadas con el complemento mediante interacción cruzada proteolítica. La actividad desregulada del sistema calicreína–cinina se ha implicado en trastornos de inflamación mediada por bradicinina y fenotipos similares al angioedema, lo que convierte a KLKB1 en una diana útil para estudios mecanísticos del acoplamiento entre hemostasia e inflamación.

plasma kallikrein El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de KLKB1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

plasma kallikrein El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus KLKB1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional KLKB1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de plasma kallikrein. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo KLKB1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de plasma kallikrein en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía plasma kallikrein en células tumorales con expresión de KLKB1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.