Plasmide CRISPR d'Activation (h) PKA IIα reg: sc-401080-ACT

PRKAR2A code la sous-unité régulatrice IIα de la protéine kinase A (PKA) dépendante de l’AMPc, un modulateur clé de l’activité des kinases qui, en l’absence d’AMPc, maintient les sous-unités catalytiques sous contrôle et ajuste l’amplitude ainsi que la compartimentation de la signalisation. Grâce à des interactions d’ancrage avec les échafaudages AKAP, PRKAR2A contribue à localiser la PKA dans des microdomaines subcellulaires définis, façonnant des programmes de phosphorylation qui contrôlent le métabolisme, la progression du cycle cellulaire, les réponses transcriptionnelles et la signalisation synaptique. Cet axe AMPc/PKA s’entrecroise avec la signalisation des RCPG et la régulation de l’expression génique dépendante de CREB, influençant la différenciation et les voies de réponse au stress. Une signalisation PKA dérégulée et une modification de l’équilibre des sous-unités régulatrices ont été associées à un contrôle anormal de la croissance et à un remodelage des voies observés dans de multiples contextes pathologiques, ce qui soutient les études mécanistiques de la transduction du signal et de la plasticité cellulaire.

PKA IIα reg Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRKAR2A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PKA IIα reg Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRKAR2A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRKAR2A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PKA IIα reg. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRKAR2A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PKA IIα reg au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PKA IIα reg dans les cellules tumorales présentant une expression de PRKAR2A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.