Plasmide CRISPR d'Activation (h) PKAγ cat: sc-400874-ACT

PRKACG code la sous-unité catalytique gamma de la protéine kinase A (PKA) dépendante de l’AMPc, un effecteur central de la signalisation GPCR–adénylyl cyclase qui phosphoryle une grande diversité de substrats afin de réguler le métabolisme, la dynamique du cytosquelette, l’activité des canaux ioniques et des programmes transcriptionnels tels que l’expression génique dépendante de CREB. Via la signalisation AMPc/PKA, PRKACG participe à l’intégration des signaux entre différentes voies, notamment la voie MAPK, les réponses dépendantes du calcium, ainsi que la régulation du cycle cellulaire et de la différenciation. Une activité PKA dérégulée et une signalisation AMPc altérée sont impliquées dans la signalisation oncogénique, des dysfonctionnements endocriniens et métaboliques, ainsi que des troubles de l’excitabilité neuronale et cardiaque, faisant de PRKACG un nœud utile pour des études mécanistiques du remodelage des voies de signalisation.

PKAγ cat Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRKACG sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PKAγ cat Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRKACG dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRKACG, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PKAγ cat. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRKACG natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PKAγ cat au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PKAγ cat dans les cellules tumorales présentant une expression de PRKACG silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.