Plasmide CRISPR d'Activation (h) PKAβ cat: sc-400649-ACT

PRKACB code la sous-unité catalytique bêta de la protéine kinase A dépendante de l’AMPc (PKAβcat), une kinase sérine/thréonine centrale qui convertit les signaux d’AMPc en programmes de phosphorylation contrôlant le métabolisme, la transcription, la progression du cycle cellulaire et la plasticité synaptique. Lors d’une élévation de l’AMPc induite par les RCPG, les sous-unités catalytiques de la PKA se dissocient des sous-unités régulatrices afin de phosphoryler des substrats tels que CREB et d’autres effecteurs de voie, intégrant des signaux à travers les axes MAPK/ERK, la régulation des canaux ioniques et la dynamique mitochondriale. L’activité de PRKACB influence la différenciation cellulaire et les réponses au stress, et une altération de la signalisation AMPc–PKA a été associée à une dérégulation du contrôle de la croissance et à des phénotypes neurobiologiques dans de multiples contextes pathologiques. En tant que nœud central de la signalisation par l’AMPc, PRKACB est fréquemment étudié pour disséquer l’architecture des voies, la régulation par rétrocontrôle et les sorties transcriptionnelles dépendantes de la phosphorylation dans les cellules humaines.

PKAβ cat Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRKACB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PKAβ cat Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRKACB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRKACB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PKAβ cat. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRKACB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PKAβ cat au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PKAβ cat dans les cellules tumorales présentant une expression de PRKACB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.