Plásmido CRISPR de Activación (h) Pitx2: sc-401426-ACT

PITX2 codifica el factor de transcripción humano tipo paired-like con homeodominio Pitx2, un regulador clave de los patrones del desarrollo y la organogénesis. Pitx2 integra señales ascendentes de las vías WNT/β-catenina y relacionadas con TGF-β para controlar programas transcripcionales que rigen la especificación del destino celular, la asimetría izquierda–derecha y la diferenciación en linajes oculares, craneofaciales, cardíacos y dentales. La expresión o función desregulada de PITX2 se asocia con malformaciones congénitas y se ha investigado en contextos de regulación epitelio–mesénquima aberrante y redes transcripcionales asociadas a tumores. Como proteína nuclear de unión al ADN, Pitx2 se estudia con frecuencia por su ocupación de promotores y potenciadores (enhancers), sus interacciones con cofactores y los circuitos génicos aguas abajo que moldean la identidad de linaje.

Pitx2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PITX2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Pitx2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PITX2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PITX2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Pitx2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PITX2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Pitx2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Pitx2 en células tumorales con expresión de PITX2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.