Plasmide CRISPR d'Activation (m) PiT1: sc-422988-ACT

Slc20a1 code pour PiT1 (SLC20A1), un transporteur de phosphate inorganique dépendant du sodium, qui assure l’absorption du phosphate nécessaire à la synthèse des nucléotides, au métabolisme des phospholipides et à l’homéostasie énergétique. Au-delà du transport, PiT1 contribue à des réseaux de signalisation qui relient la disponibilité en phosphate à la prolifération, la survie et la différenciation cellulaires, avec des liens avec la voie MAPK et d’autres voies associées à la croissance. Dans les modèles murins, l’activité de Slc20a1 est souvent étudiée dans des contextes où la gestion du phosphate influence les programmes d’ostéogenèse et de calcification vasculaire, ainsi que les processus de développement et de remodelage tissulaire. Un transport du phosphate dérégulé et la signalisation en aval sont donc pertinents pour des études mécanistiques portant sur la minéralisation, les réponses au stress métabolique et les phénotypes prolifératifs.

PiT1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Slc20a1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PiT1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Slc20a1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Slc20a1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PiT1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Slc20a1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PiT1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PiT1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Slc20a1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.