Plasmide CRISPR d'Activation (h) PIRT: sc-416125-ACT

La protéine humaine PIRT (phosphoinositide-interacting regulator of TRP channels) est codée par un gène qui produit une petite protéine associée à la membrane, capable de se lier au phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) et de moduler l’activité de certains canaux ioniques de la famille des transient receptor potential (TRP). En régulant les flux de calcium et d’autres cations dépendants des TRP, PIRT contribue à des processus de signalisation sensorielle tels que la nociception, la thermosensation et le prurit, reliant la dynamique des phosphoinositides membranaires à l’excitabilité neuronale. La signalisation associée à PIRT recoupe des voies contrôlant l’ouverture des canaux médiée par les GPCR et par les lipides, avec un impact sur les réponses des seconds messagers en aval et sur des programmes transcriptionnels dépendants de l’activité. Des altérations de la régulation des canaux TRP et de la signalisation des phosphoinositides ont été impliquées dans des phénotypes douloureux et neuro-inflammatoires, faisant de PIRT un nœud pertinent pour des études mécanistiques en biologie des neurones sensoriels et dans des modèles de maladies associées.

PIRT Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PIRT sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PIRT Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PIRT dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PIRT, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PIRT. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PIRT natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PIRT au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PIRT dans les cellules tumorales présentant une expression de PIRT silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.