Plasmide CRISPR d'Activation (h) PIPK I α: sc-403490-ACT

PIP5K1A code la phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase de type I alpha (PIPK I α), une kinase lipidique clé qui génère le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) au niveau de la membrane plasmique et des endomembranes. Le PI(4,5)P2 sert de précurseur à des seconds messagers dans la signalisation des phosphoinositides et régule directement le remodelage du cytosquelette d’actine, l’endocytose médiée par la clathrine, le trafic membranaire et la dynamique des adhérences focales. En contrôlant la disponibilité du PI(4,5)P2, PIPK I α influence des nœuds de signalisation, notamment les voies PLC/PKC et PI3K–AKT, et favorise l’organisation spatiale de la signalisation induite par les récepteurs. Une dérégulation du métabolisme des phosphoinositides et une activité altérée de PIP5K1A ont été associées à une migration cellulaire aberrante, à des phénotypes invasifs et à des contextes de signalisation oncogénique, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques des programmes de prolifération et de motilité.

PIPK I α Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PIP5K1A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PIPK I α Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PIP5K1A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PIP5K1A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PIPK I α. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PIP5K1A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PIPK I α au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PIPK I α dans les cellules tumorales présentant une expression de PIP5K1A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.