PIP5KIII CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402813-ACT

PIKFYVE kodiert die Phosphatidylinositol-3-phosphat-5-Kinase Typ III (PIP5KIII), eine Lipidkinase, die PI(3,5)P2 bildet und die Identität endolysosomaler Membranen, den Vesikeltransport sowie die Homöostase der Lysosomen unterstützt. PIP5KIII wirkt im PIKFYVE–VAC14–FIG4-Komplex und reguliert dort die Endosomenreifung, den autophagischen Fluss und nährstoffabhängige Signalwege, wodurch der Phosphoinositid-Stoffwechsel mit der zellulären Anpassung an Stress verknüpft wird. Störungen dieses Signalwegs verändern die Dynamik von Vakuolen/Lysosomen und stehen mit neurodegenerativen und neuromuskulären Phänotypen in Zusammenhang, was PIKFYVE zu einem zentralen Knotenpunkt für die Untersuchung von Defekten im Membrantransport macht. Die Regulation von humanem PIKFYVE ist zudem relevant für Studien zum Pathogeneintritt, zum Rezeptorumsatz und zu metabolischen Signalwegen, die vom endosomalen Sortieren abhängen.

PIP5KIII Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PIKFYVE-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PIP5KIII Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PIKFYVE-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PIKFYVE-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PIP5KIII-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PIKFYVE-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PIP5KIII-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PIP5KIII-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PIKFYVE-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.