Plasmide CRISPR d'Activation (m) PIG-A: sc-422226-ACT

Le gène murin **Piga** code **PIG-A**, une sous-unité catalytique essentielle de la machinerie de biosynthèse de l’ancre glycosylphosphatidylinositol (GPI), qui initie la première étape de l’assemblage du précurseur GPI dans le réticulum endoplasmique. En permettant l’ancrage GPI, PIG-A soutient l’expression à la surface cellulaire et la localisation membranaire de nombreuses protéines impliquées dans la transduction du signal, l’adhésion, l’activité enzymatique et la régulation immunitaire. Une perturbation de la fonction de PIG-A désorganise la biogenèse des ancres GPI, modifiant le trafic des protéines membranaires et la composition du protéome de surface, et est largement utilisée pour étudier les voies dépendantes de l’ancre GPI dans les lignées hématopoïétiques et autres. Une biosynthèse des ancres GPI dérégulée est impliquée dans la physiopathologie de diverses maladies, notamment des troubles hématologiques clonaux, offrant un cadre mécanistique pour modéliser, dans des systèmes expérimentaux, des déficits en protéines ancrées à la membrane.

PIG-A Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Piga sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PIG-A Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Piga dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Piga, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PIG-A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Piga natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PIG-A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PIG-A dans les cellules tumorales présentant une expression de Piga silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.