PIASx CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403954-ACT

Human PIAS2 codiert PIASx, eine E3-SUMO-Ligase der PIAS-Familie, die über SUMOylierung die Aktivität von Transkriptionsfaktoren und die Proteinstabilität moduliert. PIASx reguliert Signaltransduktion und Genexpressionsprogramme, die mit der JAK/STAT-Signalgebung, nukleären Rezeptorwegen und der DNA-schadensresponsiven transkriptionellen Kontrolle verknüpft sind, und beeinflusst dadurch die Zellzyklusprogression und die Anpassung an Stress. Durch die Feinabstimmung der Ausgabe zytokin- und hormonabhängiger transkriptioneller Netzwerke trägt PIASx zur kontextabhängigen Regulation von Proliferation und Differenzierung bei. Eine dysregulierte Aktivität des SUMO-Signalwegs und eine veränderte PIAS2-Expression wurden mit aberranten transkriptionellen Zuständen in der krebsbezogenen Biologie sowie in Modellen der inflammatorischen Signalübertragung in Verbindung gebracht.

PIASx Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PIAS2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PIASx Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PIAS2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PIAS2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PIASx-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PIAS2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PIASx-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PIASx-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PIAS2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.