Plasmide CRISPR d'Activation (m) PI 3-kinase p85α: sc-422233-ACT

Pik3r1 code la sous-unité régulatrice p85α de la phosphoinositide 3‑kinase (PI3K) de classe IA, qui stabilise et recrute les sous-unités catalytiques p110 vers les récepteurs tyrosine kinases activés et les protéines adaptatrices. En contrôlant la production de PI(3,4,5)P3, la PI3‑kinase p85α module la signalisation AKT/mTOR afin de réguler la croissance cellulaire, le métabolisme, la survie et la signalisation du récepteur de l’insuline. Dans des modèles murins, une activité modifiée de Pik3r1 influence le développement et la fonction des cellules immunitaires, l’homéostasie du glucose et les réponses à la stimulation par des facteurs de croissance. Une dérégulation de la voie PI3K est largement impliquée dans les processus oncogéniques et les mécanismes des maladies métaboliques, ce qui fait de Pik3r1 un nœud clé pour l’exploration de cette voie.

PI 3-kinase p85α Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Pik3r1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PI 3-kinase p85α Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Pik3r1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Pik3r1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PI 3-kinase p85α. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Pik3r1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PI 3-kinase p85α au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PI 3-kinase p85α dans les cellules tumorales présentant une expression de Pik3r1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.