PGC1a CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422364-ACT

Ppargc1a kodiert den transkriptionellen Koaktivator PGC1a, einen zentralen Regulator der mitochondrialen Biogenese und des oxidativen Stoffwechsels in Mausgeweben mit hohem Energiebedarf. PGC1a koordiniert Programme von nukleären Rezeptoren und Transkriptionsfaktoren, darunter PPAR-, NRF1/2- und ERR-Signalwege, um Fettsäureoxidation, oxidative Phosphorylierung und antioxidative Abwehrmechanismen fein abzustimmen. Seine Aktivität integriert Nährstoff- und Stresssignale über Signalwege wie AMPK und sirtuinabhängige Deacetylierung und prägt dadurch metabolische Flexibilität sowie das zelluläre Redoxgleichgewicht. Eine fehlregulierte Ppargc1a-Expression wurde mit Phänotypen des metabolischen Syndroms, Muskel- und kardialem Remodeling sowie mit neurodegenerationsassoziierter mitochondrialer Dysfunktion in Verbindung gebracht, wodurch es in mechanistischen Studien zur Energiehomöostase häufig als Ziel dient.

PGC1a Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ppargc1a-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PGC1a Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ppargc1a-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ppargc1a-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PGC1a-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ppargc1a-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PGC1a-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PGC1a-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ppargc1a-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.