PGAM5 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-428371-ACT

Das Mausgen *Pgam5* kodiert PGAM5, eine Ser/Thr-Phosphatase der äußeren Mitochondrienmembran, die den metabolischen Status mit Stresssignalgebung und der Qualitätskontrolle der Mitochondrien verknüpft. PGAM5 ist an der mitochondrialen Dynamik beteiligt, indem es die Spaltungsmaschinerie (Fission) reguliert, und steht in Verbindung mit Mitophagie‑Signalwegen, wodurch es die Zellantwort auf oxidativen Stress und Membrandepolarisation mitprägt. Zudem wurde es mit programmierter Zellsterblichkeit und inflammatorischen Signalkaskaden in Zusammenhang gebracht, einschließlich der Modulation von ASK1/JNK und verwandten stressaktivierten MAPK‑Netzwerken. Eine Fehlregulation PGAM5‑assoziierter Signalwege ist in Modellen für Neurodegeneration, Ischämie‑Reperfusionsschädigung und immunvermittelte Gewebeschädigung relevant und macht PGAM5 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien mitochondrialer Stressantworten.

PGAM5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Pgam5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PGAM5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Pgam5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Pgam5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PGAM5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Pgam5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PGAM5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PGAM5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Pgam5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.