Plasmide CRISPR d'Activation (h) PFK-2/PFKFB2: sc-401358-ACT

PFKFB2 code la 6‑phosphofructo‑2‑kinase/fructose‑2,6‑bisphosphatase 2 (PFK‑2/PFKFB2), une enzyme bifonctionnelle qui contrôle les niveaux cellulaires de fructose‑2,6‑bisphosphate, un puissant activateur allostérique de la PFK‑1 et du flux glycolytique. En ajustant l’équilibre entre la glycolyse et le potentiel gluconéogénique, PFKFB2 relie la disponibilité en nutriments à la production d’ATP, à l’homéostasie rédox et à l’approvisionnement en précurseurs biosynthétiques. Son activité s’intègre aux voies de signalisation insuline/PI3K–AKT et aux voies de kinases sensibles au stress, qui modulent l’adaptation métabolique. Une expression dérégulée de PFKFB2 ou une régulation dépendante de la signalisation a été associée à une reprogrammation métabolique altérée observée dans divers modèles de maladies cardiométaboliques et prolifératives, ce qui en fait un nœud utile pour l’étude de phénotypes centrés sur la glycolyse.

PFK-2/PFKFB2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PFKFB2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PFK-2/PFKFB2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PFKFB2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PFKFB2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PFK-2/PFKFB2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PFKFB2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PFK-2/PFKFB2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PFK-2/PFKFB2 dans les cellules tumorales présentant une expression de PFKFB2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.