Plasmide CRISPR d'Activation (h) Pericentrin 2: sc-401822-ACT

PCNT code la péricentrine 2, une protéine d’échafaudage centrale du matériel péricentriolaire, indispensable à la maturation du centrosome et à la nucléation des microtubules. En organisant les complexes en anneau de la γ-tubuline et en ancrant des protéines régulatrices telles qu’AURKA et PLK1, la péricentrine 2 soutient l’assemblage du fuseau mitotique, la ségrégation des chromosomes et la ciliogenèse. La perturbation de l’architecture centrosomale dépendante de PCNT dérègle le contrôle du cycle cellulaire et la stabilité génomique, des processus fréquemment impliqués dans les troubles du développement et l’aneuploïdie associée aux cancers. Comme l’intégrité du centrosome influence les sorties de signalisation du cil primaire, PCNT est également pertinente pour l’étude des voies de signalisation liées aux cils et de la polarité cellulaire.

Pericentrin 2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PCNT sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Pericentrin 2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PCNT dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PCNT, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Pericentrin 2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PCNT natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Pericentrin 2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Pericentrin 2 dans les cellules tumorales présentant une expression de PCNT silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.