Pericentrin 2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401822-ACT

PCNT kodiert Pericentrin 2, ein zentrales Gerüstprotein des perizentriolaren Materials, das für die Zentrosomenreifung und die Nukleation von Mikrotubuli essenziell ist. Durch die Organisation von γ‑Tubulin‑Ringkomplexen und die Verankerung regulatorischer Proteine wie AURKA und PLK1 unterstützt Pericentrin 2 den Aufbau der mitotischen Spindel, die Chromosomensegregation und die Ziliogenese. Eine Störung der PCNT‑abhängigen Zentrosomenarchitektur beeinträchtigt die Zellzykluskontrolle und die genomische Stabilität – Prozesse, die häufig mit Entwicklungsstörungen und krebsassoziierter Aneuploidie in Verbindung stehen. Da die Integrität des Zentrosoms die Signalweitergabe der primären Zilie beeinflusst, ist PCNT auch für Studien zu ziliengekoppelten Signalwegen und zur zellulären Polarität relevant.

Pericentrin 2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PCNT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Pericentrin 2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PCNT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PCNT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Pericentrin 2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PCNT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Pericentrin 2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Pericentrin 2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PCNT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.