PEPCK-M/PCK2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400725-ACT

Das humane **PCK2**-Gen kodiert die mitochondriale Isoform der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (**PEPCK-M**), ein zentrales gluconeogenes Enzym, das Oxalacetat unter Verwendung von GTP in Phosphoenolpyruvat umwandelt. Durch die Kopplung der mitochondrialen Anaplerose/Kataplerose an die zytosolische Kohlenhydrat- und Lipidbiosynthese trägt PEPCK-M zur Koordination des Flusses im Citratzyklus (TCA-Zyklus), der Redoxbalance und der nährstoffabhängigen metabolischen Flexibilität bei. Die Aktivität von PCK2 ist mit dem zentralen Kohlenstoffstoffwechsel verknüpft und kann Wege wie Gluconeogenese, Glyceroneogenese sowie die Nutzung von aus Aminosäuren stammendem Kohlenstoff beeinflussen. Eine veränderte PCK2-Expression wurde mit dem metabolischen „Rewiring“ in Störungen der Glukosehomöostase sowie im Tumorstoffwechsel in Verbindung gebracht, was PCK2 zu einem geeigneten Knotenpunkt macht, um die mitochondriale Kontrolle biosynthetischer Programme zu untersuchen.

PEPCK-M/PCK2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PCK2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PEPCK-M/PCK2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PCK2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PCK2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PEPCK-M/PCK2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PCK2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PEPCK-M/PCK2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PEPCK-M/PCK2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PCK2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.