Plasmide CRISPR d'Activation (h) PDK1: sc-401084-ACT

La PDK1 humaine (pyruvate dehydrogenase kinase 1) est une kinase mitochondriale qui phosphoryle et inhibe le complexe pyruvate déshydrogénase, limitant la conversion du pyruvate en acétyl‑CoA et détournant le flux carboné de l’oxydation mitochondriale. En couplant la disponibilité en nutriments et la tension en oxygène au métabolisme central du carbone, PDK1 influence la glycolyse, l’entrée dans le cycle de l’ATC (TCA) et l’équilibre rédox cellulaire, et est couramment associée au remodelage métabolique dépendant de l’hypoxie. Une activité altérée de PDK1 a été associée à des phénotypes prolifératifs et d’adaptation au stress observés dans le métabolisme tumoral et dans d’autres troubles caractérisés par une dysfonction mitochondriale.

PDK1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PDK1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PDK1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PDK1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PDK1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PDK1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PDK1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PDK1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PDK1 dans les cellules tumorales présentant une expression de PDK1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.