Plasmide CRISPR d'Activation (m) PDE6β: sc-422166-ACT

Le gène murin *Pde6b* code la sous-unité bêta de la phosphodiestérase 6 du cGMP (PDE6β), un effecteur central de la cascade de phototransduction des bâtonnets. Dans les photorécepteurs rétiniens de type bâtonnet, PDE6β hydrolyse le cGMP en aval de la signalisation rhodopsine–transducine activée par la lumière, régulant ainsi l’activité des canaux activés par les nucléotides cycliques, l’hyperpolarisation membranaire et les processus d’adaptation dépendants du calcium. Un fonctionnement adéquat de PDE6β est essentiel au maintien de l’homéostasie des photorécepteurs et de la fidélité du signal, ce qui relie cette enzyme aux études de la transduction sensorielle, du métabolisme du cGMP et de la biologie du segment externe. La dérégulation ou la perte d’activité de PDE6β est largement utilisée dans des modèles expérimentaux de dégénérescence rétinienne héréditaire, permettant des analyses mécanistiques des réponses au stress des photorécepteurs, du remodelage synaptique et des phénotypes liés à la vision.

PDE6β Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Pde6b sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PDE6β Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Pde6b dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Pde6b, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PDE6β. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Pde6b natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PDE6β au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PDE6β dans les cellules tumorales présentant une expression de Pde6b silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.