PDE4D CRISPR Activation Plasmid (m): sc-433646-ACT

Das Mausgen **Pde4d** kodiert die Phosphodiesterase 4D (PDE4D), eine cAMP-spezifische Phosphodiesterase, die cAMP zu 5′-AMP hydrolysiert und die Amplitude sowie die räumliche Begrenzung der PKA- und EPAC-abhängigen Signalübertragung formt. Durch die Regulation des intrazellulären Second-Messenger-Grundtonus beeinflusst PDE4D GPCR-vermittelte Antworten, Transkriptionsprogramme wie die CREB-Signalisierung sowie Prozesse einschließlich Zellproliferation, Differenzierung und Immunmodulation. Die PDE4D-Aktivität ist über A-Kinase-Ankerproteine in kompartimentalisierte Signalgebung eingebunden und kann über Crosstalk mit cAMP-Effektoren die Dynamik des MAPK/ERK-Signalwegs beeinflussen. Eine fehlregulierte, durch PDE4D vermittelte cAMP-Umsetzung wurde mit Entzündung und neurobiologischen Phänotypen in Verbindung gebracht, was PDE4D als mechanistischen Knotenpunkt für krankheitsrelevante Signalstudien in Mausmodellen unterstützt.

PDE4D Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Pde4d-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PDE4D Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Pde4d-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Pde4d-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PDE4D-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Pde4d-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PDE4D-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PDE4D-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Pde4d-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.