Plasmide CRISPR d'Activation (h) PDE3B: sc-401773-ACT

La phosphodiestérase 3B (PDE3B) est une phosphodiestérase des nucléotides cycliques à double spécificité qui hydrolyse l’AMPc et le GMPc afin d’ajuster, de manière dépendante du type cellulaire, la dynamique de la signalisation par seconds messagers. En limitant la signalisation AMPc/PKA et en s’articulant avec des signaux d’origine insulinique, adrénergique et inflammatoire, PDE3B contribue à la régulation de la lipolyse, de l’homéostasie du glucose et de l’équilibre énergétique, avec des rôles marqués dans les adipocytes et dans la signalisation métabolique liée aux hépatocytes. L’activité de PDE3B influence des programmes transcriptionnels en aval ainsi que des réseaux de phosphorylation qui affectent le métabolisme des lipides, la fonction mitochondriale et des voies sensibles aux cytokines. Une expression ou une signalisation de PDE3B dérégulée a été associée à des phénotypes de maladies métaboliques et à des voies de risque cardiométabolique, ce qui étaye son utilisation comme nœud mécanistique dans les études de la résistance à l’insuline et des troubles associés.

PDE3B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PDE3B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PDE3B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PDE3B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PDE3B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PDE3B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PDE3B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PDE3B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PDE3B dans les cellules tumorales présentant une expression de PDE3B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.