PD-ECGF CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403836-ACT

TYMP kodiert die Thymidinphosphorylase, auch bekannt als platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF), ein zytosolisches Enzym, das die Phosphorolyse von Thymidin und Desoxyuridin katalysiert und so Nukleosidpools sowie den Nukleotid-„Salvage“-Stoffwechsel reguliert. Über seinen Einfluss auf den Pyrimidinstoffwechsel wirkt TYMP auf Antworten auf DNA-Replikationsstress, das mitochondriale Nukleotidgleichgewicht sowie die allgemeine zelluläre Redox- und metabolische Homöostase. Die PD-ECGF-Aktivität wurde mit der Endothelbiologie und dem Gewebeumbau in Verbindung gebracht, unter anderem über metabolitgetriebene Signalwirkungen, und verknüpft damit den Nukleosidstoffwechsel mit angiogenen Programmen. Eine dysregulierte TYMP-Expression oder -Funktion ist mit verändertem Nukleotidstoffwechsel assoziiert, wie er bei proliferativen und mitochondrialen Erkrankungen beobachtet wird, was TYMP als Ziel für mechanistische Untersuchungen in stoffwechselassoziierten Krankheitsmodellen unterstützt.

PD-ECGF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TYMP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PD-ECGF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TYMP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TYMP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PD-ECGF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TYMP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PD-ECGF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PD-ECGF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TYMP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.