Plasmide CRISPR d'Activation (h) PCPE-1: sc-404359-ACT

PCOLCE code pour la protéine 1 amplificatrice de la procollagène C-endopeptidase (PCPE-1), une glycoprotéine sécrétée de la matrice extracellulaire qui potentialise le traitement du procollagène fibrillaire par les métalloprotéinases de type BMP1/tolloid en augmentant le clivage du C-propeptide. Par cette activité de cofacteur, PCPE-1 soutient la maturation du collagène, le dépôt de matrice et le remodelage tissulaire, ce qui la relie à l’organisation de la matrice extracellulaire et à la protéostasie dans les tissus conjonctifs. La fonction de PCPE-1 s’inscrit à l’interface des voies de biosynthèse du collagène et de renouvellement de la matrice qui façonnent l’architecture stromale et la signalisation cellule–matrice. Une régulation altérée de l’expression de PCOLCE et du traitement du collagène a été associée au remodelage fibrotique et à d’autres pathologies caractérisées par une accumulation anormale de matrice extracellulaire.

PCPE-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PCOLCE sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PCPE-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PCOLCE dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PCOLCE, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PCPE-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PCOLCE natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PCPE-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PCPE-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de PCOLCE silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.