Plasmide CRISPR d'Activation (h2) PCNA: sc-400037-ACT-2

La PCNA humaine (proliferating cell nuclear antigen) est une pince coulissante d’ADN homotrimérique qui sert de plateforme centrale pour les ADN polymérases ainsi que pour de nombreux facteurs de réparation et de modification de la chromatine, coordonnant une synthèse d’ADN hautement processive durant la phase S. Elle assure l’intégration de la réplication avec les voies de tolérance aux dommages de l’ADN et de réparation, notamment la réparation des mésappariements, la réparation par excision de base, la réparation par excision de nucléotides et la synthèse translésionnelle, et son activité est régulée par des modifications post-traductionnelles telles que l’ubiquitination et la SUMOylation, qui influencent la sélection de ses partenaires. Une expression dérégulée de PCNA ou des réseaux d’interactions altérés sont fréquemment associés à l’instabilité génomique et à la prolifération aberrante observées dans les cancers et d’autres pathologies liées au stress réplicatif. PCNA est largement utilisée en recherche biomédicale comme marqueur de la progression du cycle cellulaire et comme point d’entrée mécanistique pour étudier l’architecture du replisome, la dynamique des fourches de réplication et le choix des voies de réparation dans les cellules humaines.

PCNA Le plasmide d'activation CRISPR (h2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PCNA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PCNA Le plasmide d'activation CRISPR (h2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PCNA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PCNA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PCNA. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PCNA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PCNA au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PCNA dans les cellules tumorales présentant une expression de PCNA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.