PCLAF CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402724-ACT

PCLAF (PCNA clamp associated factor, auch als KIAA0101 bekannt) ist ein PCNA-bindendes Protein, das die DNA-Replikation und -Reparatur koordiniert, indem es die prozessive DNA-Synthese sowie die Rekrutierung von Reparaturfaktoren an ins Stocken geratenen Replikationsgabeln moduliert. Es ist an der Zellzyklusprogression beteiligt, insbesondere in der S‑Phase, und beeinflusst die Genomstabilität über Signalwege, die mit Replikationsstressantworten und der postreplikativen Toleranz gegenüber DNA-Schäden verknüpft sind. Eine veränderte PCLAF-Expression wurde in mehreren krebsbezogenen Kontexten mit proliferativen Phänotypen und einer dysregulierten Checkpoint-Kontrolle in Verbindung gebracht, was PCLAF zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung replikationsgekoppelter Chromatindynamik macht. Forschende untersuchen PCLAF häufig, um PCNA-abhängige Signalgebung, Netzwerke der DNA-Schadensantwort und Transkriptionsprogramme zu verknüpfen, die eine schnelle Zellteilung unterstützen.

PCLAF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PCLAF-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PCLAF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PCLAF-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PCLAF-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PCLAF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PCLAF-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PCLAF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PCLAF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PCLAF-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.