Plasmide CRISPR d'Activation (h) PCLAF: sc-402724-ACT

PCLAF (facteur associé au clamp PCNA, également connu sous le nom de KIAA0101) est une protéine se liant à PCNA qui coordonne la réplication et la réparation de l’ADN en modulant la synthèse processive de l’ADN et le recrutement de facteurs de réparation au niveau des fourches de réplication bloquées. Elle participe à la progression du cycle cellulaire, en particulier en phase S, et influence la stabilité du génome via des voies liées aux réponses au stress de réplication et à la tolérance post-réplicative aux dommages de l’ADN. Une expression altérée de PCLAF a été associée à des phénotypes prolifératifs et à une régulation anormale des points de contrôle dans de multiples contextes liés au cancer, ce qui en fait un nœud d’intérêt pour l’étude des dynamiques de la chromatine couplées à la réplication. Les chercheurs étudient couramment PCLAF afin d’établir des liens entre la signalisation dépendante de PCNA, les réseaux de réponse aux dommages de l’ADN et les programmes transcriptionnels qui soutiennent une division cellulaire rapide.

PCLAF Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PCLAF sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PCLAF Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PCLAF dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PCLAF, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PCLAF. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PCLAF natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PCLAF au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PCLAF dans les cellules tumorales présentant une expression de PCLAF silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.