Plasmide CRISPR d'Activation (h) PB1: sc-403988-ACT

PBRM1 code la sous-unité PB1 de la forme PBAF du complexe SWI/SNF (BAF) de remodelage de la chromatine dépendant de l’ATP, dont les bromodomaines reconnaissent les histones acétylées afin de réguler l’accessibilité des promoteurs et des enhancers. En coordonnant le positionnement des nucléosomes, PB1 contribue à contrôler des programmes transcriptionnels liés aux réponses aux dommages de l’ADN, à la différenciation et au maintien de la stabilité du génome. Une altération de la fonction de PBRM1 est fréquemment associée à une dérégulation épigénétique et à une dysrégulation transcriptionnelle dans des contextes pathologiques humains, notamment dans des cancers où les voies de remodelage de la chromatine sont souvent perturbées. Ces propriétés font de PB1 un nœud utile pour étudier comment l’état de la chromatine contrôle l’expression génique et le recâblage des voies de signalisation en réponse au stress et aux signaux développementaux.

PB1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PBRM1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PB1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PBRM1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PBRM1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PB1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PBRM1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PB1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PB1 dans les cellules tumorales présentant une expression de PBRM1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.