Plasmide CRISPR d'Activation (h) PAR4: sc-401142-ACT

PAWR code la protéine pro‑apoptotique PAR4 (prostate apoptosis response‑4), un régulateur du destin cellulaire contenant une fermeture éclair à leucines, qui module les réseaux transcriptionnels et de réponse au stress. PAR4 participe à l’apoptose intrinsèque et au contrôle de la croissance en influençant la signalisation NF‑κB, les voies de survie PKC/AKT et les programmes de mort cellulaire dépendants des caspases, avec des rôles additionnels dans le stress du réticulum endoplasmique (RE) et la protéostasie. Une activité altérée de PAWR/PAR4 a été associée à une apoptosis dérégulée, à l’homéostasie épithéliale et neuronale, ainsi qu’à des liens dépendants du contexte avec la biologie tumorale et des processus neurodégénératifs. Ces fonctions font de PAWR un nœud utile pour étudier les interactions (crosstalk) entre la signalisation de survie, la régulation transcriptionnelle et la mort cellulaire programmée.

PAR4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PAWR sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PAR4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PAWR dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PAWR, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PAR4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PAWR natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PAR4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PAR4 dans les cellules tumorales présentant une expression de PAWR silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.