Plasmide CRISPR d'Activation (h) PAP-α: sc-403906-ACT

PAPOLA code la poly(A) polymérase alpha (PAP-α), une enzyme centrale de la maturation de l’extrémité 3′ des ARNm qui catalyse la polyadénylation après le clivage du pré-ARNm. En déterminant la longueur de la queue poly(A) et en favorisant l’assemblage des protéines liant la poly(A), PAP-α influence la stabilité des ARNm, leur export nucléaire et l’efficacité de la traduction à travers divers programmes génétiques. PAPOLA agit au sein de la machinerie de clivage et de polyadénylation et interagit avec les voies de contrôle qualité des ARN ainsi qu’avec les voies de maturation des ARN couplées à la transcription. Une dérégulation de la maturation de l’extrémité 3′ et du contrôle des queues poly(A) est associée à des états d’expression génique altérés observés dans des contextes de prolifération et d’adaptation au stress, ce qui justifie l’étude de PAPOLA dans le remodelage du transcriptome pertinent pour les maladies.

PAP-α Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PAPOLA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PAP-α Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PAPOLA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PAPOLA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PAP-α. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PAPOLA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PAP-α au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PAP-α dans les cellules tumorales présentant une expression de PAPOLA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.