Plasmide CRISPR d'Activation (h) PAF acetylhydrolase 2: sc-410924-ACT

PAFAH2 code pour l’acétylhydrolase du PAF 2, une phospholipase A2 cytosolique qui hydrolyse le facteur d’activation plaquettaire (PAF) ainsi que des phospholipides oxydés, modulant ainsi la signalisation des lipides bioactifs et l’homéostasie des lipides membranaires. En limitant la signalisation induite par le PAF et en éliminant les phospholipides peroxydés, PAFAH2 contribue à la régulation des réponses inflammatoires, du stress oxydatif et des voies en aval liées à la survie cellulaire et au remodelage lipidique. Une altération du contrôle du PAF et des médiateurs lipidiques oxydés a été associée à une dérégulation de la signalisation immunitaire et à des phénotypes de stress métabolique, ce qui fait de PAFAH2 une cible pertinente pour des études mécanistiques des dysfonctionnements cellulaires associés à l’inflammation.

PAF acetylhydrolase 2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PAFAH2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PAF acetylhydrolase 2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PAFAH2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PAFAH2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PAF acetylhydrolase 2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PAFAH2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PAF acetylhydrolase 2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PAF acetylhydrolase 2 dans les cellules tumorales présentant une expression de PAFAH2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.